煙草在線據(jù)云南煙葉信息網(wǎng)報(bào)道　　近日發(fā)表在《煙草科技》2016年第6期上的“基于CRISPR/Cas9技術(shù)的煙草NtDXR基因敲除及功能分析”研究揭示，NtDXR基因在煙草葉綠素等色素合成中起重要作用，NtDXR基因敲除后發(fā)現(xiàn)有堿基插入、缺失與置換，部分T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株呈現(xiàn)白化表型，推測(cè)NtDXR基因突變能阻斷煙草質(zhì)體色素合成。

　　5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）是2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）生物合成途徑中的第一個(gè)限速酶，能催化5-　磷酸脫氧木酮糖（DXP）生成MEP。由MEP途徑合成的西柏烷類(lèi)化合物、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)化合物和巖薔薇類(lèi)化合物是煙葉重要的致香前體物質(zhì)，DXR基因表達(dá)的強(qiáng)弱會(huì)影響煙葉中單萜、雙萜以及四萜類(lèi)物質(zhì)的重新分配，影響煙葉品質(zhì)。

　　該研究從普通煙草品種紅花大金元中克隆獲得NtDXR基因，采用熒光定量PCR技術(shù)分析NtDXR在紅花大金元不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的表達(dá)模式，同時(shí)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了NtDXR敲除載體，獲得了DXR基因突變的植株。結(jié)果表明，NtDXR基因在花中高表達(dá)，在雌蕊和葉中次之；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除NtDXR基因后，檢測(cè)目的基因靶位點(diǎn)序列發(fā)現(xiàn)有堿基插入、缺失與置換，并且部分T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株呈現(xiàn)白化表型，暗示NtDXR基因在煙草葉綠素等色素合成過(guò)程中起重要作用，推測(cè)NtDXR基因的突變能阻斷煙草質(zhì)體色素的合成。

　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年發(fā)展迅速的一種基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)利用向?qū)NA（guide RNA）與基因的靶序列結(jié)合，在Cas9核酸內(nèi)切酶的作用下對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，基因組斷裂后啟動(dòng)DNA修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)過(guò)程中可能有堿基的插入、缺失和置換，從而引起蛋白翻譯發(fā)生錯(cuò)誤，導(dǎo)致基因功能喪失。該研究明確了NtDXR基因在煙草萜類(lèi)化合物代謝中的作用，為選育煙草優(yōu)良品種提供理論基礎(chǔ)。

左圖為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性組培苗，右圖為呈白化表型的轉(zhuǎn)基因植株

圖1　轉(zhuǎn)基因植株T0代表型

M. Trans2K DNA Marker 1-6. pORE-Cas9/gRNA-NtD transgenic plants

　　XR載體菌液PCR產(chǎn)物。a.敲除載體PCR電泳圖　b.敲除載體測(cè)序結(jié)果分析（紅色堿基為靶位點(diǎn)序列）　c.敲除載體示意圖

圖2　敲除載體檢測(cè)及結(jié)構(gòu)示意圖

圖3　轉(zhuǎn)基因煙株內(nèi)源NtDXR　基因序列分析（藍(lán)色堿基為靶位點(diǎn)，紅色堿基為突變位點(diǎn)）